Утвержден анализ на висцеральный лейшманиоз путем изотермической амплификации с формированием петель

Висцеральный лейшманиоз (ВЛ) является одним из тех инфекционных заболеваний, лечению которых часто не уделяется должного внимания, при этом ежегодная заболеваемость составляет от 50 000 до 90 000 новых случаев во всем мире. Случаи ВЛ характеризуются нерегулярными приступами лихорадки, потерей веса, гепатоспленомегалией, гипергаммаглобулинемией, панцитопенией и анемией.

Диагноз ВЛ основан на сочетании клинического обследования с лихорадкой более двух недель в анамнезе, со спленомегалией и гепатомегалией, с положительными паразитологическими или серологическими тестами. Выявление амастигот под микроскопом является инвазивной, рискованной и технически сложной задачей, которая к тому же ограничена низкой чувствительностью.

Команда ученых, проводивших работу в кампусе больницы Сафдарджунг (Safdarjung Hospital Campus; Пуна, Индия), включила в исследование 267 участников, среди них были 179 лиц со случаями ВЛ и 88 человек в контрольной группе. Подозреваемые на ВЛ, имеющие лихорадку в течение более двух недель и прибывающие из эндемичной области с ВЛ, были проверены с использованием экспресс-теста, тест-полоски rK39 и/или микроскопического исследования окрашенных по Гимзе аспиратов селезенки или костного мозга на наличие амастигот Leishmania donovani.

Команда создала упрощенный анализ изотермической амплификации с формированием петель (Loop Mediated Isothermal Amplification - LAMP), основанный на прямом лизисе крови (direct blood lysis) – DBL-LAMP, который был разработан и проверен на диагностическую точность. Также проверку прошел LAMP-анализ с закрытыми пробирками, описанный ранее. В конце реакции пробиркам давали остыть до комнатной температуры и задавали кратковременное вращение, чтобы обеспечить смешивание SYBR Green I с амплифицированным продуктом. Положительные образцы мгновенно стали зелеными, негативные остались оранжевыми.

Ученые сообщили, что чувствительность и специфичность LAMP-анализа составили 98,3% и 96,6% соответственно. Анализ ROC-кривой показал отсутствие существенной разницы между площадью под кривой (AUCROC) для анализа LAMP и экспресс-теста rK39, что указывает на LAMP как на отличный диагностический тест. Анализ DBL-LAMP, выполненный на 67 образцах с ВЛ и 100 контрольных образцах, показал чувствительность 93,1% и специфичность 100%. Анализ DBL-LAMP для диагностики ВЛ легче проводить, он характеризуется снижением затрат и сокращением времени выполнения, что приближает его на один шаг вперед к полевому применению. Общее время проведения анализа LAMP было уменьшено наполовину (1,25 часа), когда вместо экстракции ДНК использовался прямой лизис крови, что превосходит требование выделения ДНК путем использования неочищенного прямого лизированного супернатанта вместо ДНК.

Авторы пришли к выводу, что утвержденная LAMP с закрытыми пробирками для диагностики ВЛ послужит стимулом для текущей программы ликвидации ВЛ на индийском субконтиненте. Анализ, основанный на прямом лизисе крови, расширяет возможности его применения в полевых условиях, дополнительно сокращая время и затраты. Исследование было опубликовано 15 ноября 2018 года в журнале "Общественная библиотека наук о забытых тропических болезнях" (Public Library of Science Neglected Tropical Diseases).

Ссылки по теме:
Кампус больницы Сафдарджунг