Анализ капли крови позволит осуществлять мониторинг устойчивости к противомалярийным препаратам

Молекулярное обнаружение, по всей видимости, является наиболее эффективным методом, но при этом оно также является наиболее сложным, поскольку требует выделения ДНК и использования инструментария ПЦР.

Чтобы разработать методику, более подходящую для использования за пределами традиционной лаборатории, исследователи из Университета Вандербильта (Нэшвилл, штат Теннесси, США) создали новые тесты, которые при использовании в сочетании с толерантной к ингибитору Taq-полимеразой (inhibitor-tolerant Taq polymerase) позволили генотипировать однонуклеотидный полиморфизм непосредственно из цельной крови. Фермент Taq-полимераза представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу I, получившую название от термофильной бактерии Thermus aquaticus, из которой он был первоначально выделен. Он часто используется в полимеразной цепной реакции (ПЦР) – методе, направленном на значительное увеличение количества коротких сегментов ДНК.

Новые тесты имеют два ключевых конструктивных элемента: запертые нуклеиновые кислоты для повышения специфичности и репортерные красители Cy5 и TEX615, которые имеют меньшее оптическое перекрытие со спектрами поглощения крови, чем другие обычно используемые красители. Эффективность тестов была проверена на традиционном лабораторном приборе, а затем они были дополнительно протестированы на применяемой в полевых условиях методике адаптивной ПЦР.

Адаптивная ПЦР представляет собой ранее описанную платформу для ПЦР в реальном времени, использующую добавление левозакрученной ДНК (Z-ДНК) для контроля протекания реакции с целью большей результативности в месте оказания медицинской помощи. Этот метод оказался существенно проще и надежнее, чем традиционная ПЦР. Он функционирует за счет динамического управления термоциклированием посредством прямого мониторинга двух ключевых событий гибридизации – отжига праймера и плавления продукта во время реакции.

Результаты, полученные в ходе исследования, показали, что тесты позволяют различать P. falciparum дикого типа и хлорохин-резистентного мутанта в присутствии 2% крови. Эта стратегия значительно упростила выявление однонуклеотидного полиморфизма и предоставила более доступную альтернативу для наблюдения за устойчивостью к малярии в полевых условиях.

“Чтобы облегчить ингибирование компонентами крови, мы реконструировали молекулярные технологии, используемые для анализа ДНК. Мы применили репортерные красители, более оптически совместимые с кровью, в сочетании с определенным типом подгруппы ДНК для точного определения мутаций. Конечным результатом является анализ, в котором кровь непосредственно добавляется в реакционную пробирку для выявления мутаций, связанных с устойчивостью к противомалярийным лекарственным препаратам”, — говорит старший автор исследования доктор Фредерик Р. Хазелтон (Frederick R. Haselton), профессор биомедицинской инженерии и химии в Университете Вандербильта.

Исследование устойчивости к малярии было опубликовано в интернет-издании Journal of Molecular Diagnostics от 13 июня 2019 года.

Ссылки по теме:
Vanderbilt University